Лечение астмы на генетическом уровне

LiveInternetLiveInternet

—Метки

—Музыка

Астму можно вылечить на генетическом уровне

Британские ученые совершили открытие, которое может положить конец заболеваемости астмой. Они обнаружили, что ген, контролирующий кашель, чихание и одышку, можно отключить.

Исследователи из Университета Саутгемптона разpaбатывают революционный подход к лечению астмы. В настоящее время врачи используют методику профилактики приступов астмы, направленную на борьбу с основным симптомом этой болезни — воспалениями воздушных проходов. Именно эти воспаление и вызывают проблемы при дыхании, однако данный подход не способен остановить развития астмы изначально. Британские ученые утверждают, что это можно сделать за счет направленного воздействия на ген ADAM33.

Именно он отвечает за производство ферментов, которые присоединяются к клеткам мышц воздушных проходов. У людей с вариантами этого гена ферменты отсоединяются от клеток и «путешествуют» вокруг легких. Это приводит к созданию большего объема мышечной ткани и кровотоков вокруг воздушных проходов, что и вызывает проблемы с дыханием. Но отключение данного гена приостанавливает все симптомы астмы. По крайней мере, именно этот эффект был достигнут в опытах на мышах.

Открытие британских ученых не только привело к созданию потенциально нового и мощного средства лечения астмы, оно также углубило и понимания самой болезни. На протяжении длительного времени ученые считали, что перестройка воздушных проходов является результатом воспалительных процессов, вызываемых аллергической реакцией. Теперь же доказано, что эта перестройка рождается под влиянием гена ADAM33, но не воспалений.

Примерно 300 миллионов человек в разных странах мира страдают от астмы, которая в некоторых наиболее тяжелых случаях может приводить к cмepти. В настоящее время жертвы этой болезни используют два ингалятора. Синий применяется для расслабления напряженных воздушных проходов, а коричневый содержит стероиды, которые снижают воспалительный процесс в легких. (ЧИТАТЬ ДАЛЕЕ)

Лечение астмы на генетическом уровне

Russel Hopp, MD

Генетика астмы

Академия иммунологии США

В последнее время все чаще появляются публикации, посвященные генетическим исследованиям астмы. Это позволяет предположить, что в ближайшие несколько лет ген или гены, ответственные за развитие этого заболевания, будут обнаружены. Несмотря на то, что астма является весьма распространенным заболеванием, генетического объяснения ее развития не существует. Более ранние клинические исследования астмы и аллергии у близнецов однозначно указывали на наличие генетических причин обоих заболеваний. Современные методы генетических исследований позволяют точно определить, является ли заболевание генетически обусловленным. Однако при попытке выяснить роль генов в развитии астмы ученые столкнулись с большими трудностями.

Проявления астмы в фенотипе

Астму довольно часто относят к разряду синдромов, а не одиночных заболеваний. У этой теории есть целый ряд клинических подтверждений. У грудных младенцев и детей младшего возраста часто отмечается стерторозное дыхание. Однако такое дыхание может сопровождать множество заболеваний, поэтому в этой возрастной группе генетические исследования пpaктически не проводятся. Генетический анализ применяют при обследовании больных астмой детей старше 6 лет.

Одним из важнейших факторов развития астмы у детей является атопия (наследственная предрасположенность к аллергическим заболевания). Поэтому основная задача генетических исследований — выяснить, является ли заболевание астмой или атопическим состоянием.

У взрослых наблюдается другое клиническое проявление астмы, когда нет очевидных аллергических «активаторов» заболевания. До сих пор наследственную бронхиальную астму не изучали отдельно.

Астма может иметь различные клинические проявления. С помощью генетических исследований можно определить, каким именно типом астмы страдает конкретный пациент.

Поиск генов

Чаще всего участниками генетических исследований астмы становятся братья и сестры (особенно близнецы) и большие семьи. В этих исследованиях для определения заболевания используют следующие признаки астматических состояний.

При генетических исследованиях тесты, упомянутые в таблице, помогают однозначно отнести пациента к разряду астматиков. Поиск «генов астмы» ведется на основании имеющейся биологической информации об этом заболевании. При таком методе генетический анализ направлен на определение статистической зависимости между астмой и наличием определенного гена или специфических хромосом. Результаты исследований позволяют связать с аллергией такие гены, как IL-4, IL-5, рецептор иммуноглобулина Е и бета-адренергический рецептор. Если имеется статистически существенная связь между наличием астмы и наличием известного маркера на специфической хромосоме, то можно предположить, что ген астмы находится в этой хромосоме, в области данной повторяющейся последовательности оснований. В сущности, такой генетический анализ — это процесс определения «города, района, улицы и точного адреса». К настоящему времени ученым удалось обнаружить несколько «городов» (хромосом) и «районов» (последовательностей генов).

На сегодняшний день основное внимание привлекают хромосомы 5 и 11. В хромосоме 5 сосредоточены гены IL-4, IL-5, IL-3 и IL-13, которые имеют отношение к аллергии. Исследования показывают, что эта область генов отвечает за сверхчувствительность бронхов к гистамину. Кроме того, хромосома 5 (а именно, область генов IL-4 и IL-13) отвечает за концентрацию иммуноглобулина Е в сыворотке крови. А в хромосоме 11 был обнаружен важный ген атопии (рецептор иммуноглобулина Е).

К сожалению, у представителей разных рас результаты генетических исследований астмы оказались разными, что затрудняет однозначное выявление гена астмы.

Геномные исследования

Геномный подход позволяет идентифицировать гены, которые до сих пор не вызывали подозрений. Используя целый геном, специалисты ищут специфические сигнальные зоны, внутри которых ведется дальнейший поиск генов. Так, у афро-американцев многообещающими оказались некоторые зоны хромосом 5 и 17. В других исследованиях была обнаружена связь между отдельными клиническими параметрами астмы и атопии и хромосомами 2, 21, 11, 19, 7 и 16. Не исключено, что искомый ген находится в одной из них.

Структурные вариации генов

Если будет обнаружен «ген астмы», то для окончательного выяснения этиологии астмы нужно будет исследовать все формы этого гена. Основной вопрос заключается в том, определяют ли структурные различия само наличие болезни, ее форму или степень тяжести.

Заключение

Астма уже давно считается генетическим заболеванием, возможно, полигенного происхождения. Современные генетические исследования полностью подтверждают эти взгляды, и, вполне вероятно, скоро специалистам удастся окончательно установить генетические истоки астмы.

Перевод с английского Натальи Байч

Лечение астмы на генетическом уровне

Опубликовано Редакция в 12/06/10 • Категории Педиатрия

Обсуждается генетический компонент развития бронхиальной астмы. Гены-кандидаты расположены на хромосомах 2, 4, 7, на кластере цитокинов, на хромосоме 5 и на хромосоме 6 в области MHC.

Genetics of bronchial asthma

Authors discussed genetic component development of bronchial asthma. Candidate genes located on chromosomes 2, 4, 7, on a cluster of cytokines, on chromosome 5 and on chromosome 6 in the MHC.

Бронхиальная астма (БА) — заболевание с выраженной наследственной предрасположенностью. Дети, имеющие родственников первой линии родства с БА, имеют высокий риск развития клинических проявлений астмы [1]. Некоторые клиницисты большое внимание уделяют признакам мезенхимальной дисплазии как внешним маркерам генетических особенностей. У пациентов с БА часто встречаются множественные стигмы дисморфогенеза, патология соединительной ткани, кожные факомы. По итогам близнецовых исследований, генетический вклад в развитие БА оценивается в 30-70%.

Риск атопии у пробанда при достижении им возраста 7 лет в зависимости от наличия атопии в семейном анамнезе

БА — типичное заболевание мультифакториальной природы, развитие которого определяется взаимодействием наследственных факторов (мутаций или сочетаний аллелей) и факторов среды.

В последние годы генетические исследования при астме ведутся по нескольким направлениям: выявление вариантов генов, которые могут предсказать ответ на терапию, выявление вариантов генов, которые связаны с развитием болезни и играющих решающую роль в патофизиологии заболевания.

Верифицированы несколько групп генов-кандидатов, которые важны в развитии БА.

Гены атопии или гумopaльного иммунного ответа локализованы в участках хромосомы 5q24-33 и содержат кластер семейства генов цитокинов (IL-4, IL-5, IL-13, IL-3, GM-CSF), ответственный за развитие реакций немедленного типа (IgE-опосредованных реакций). IL-4, IL-13 экспрессируются Th-2 лимфоцитами и способствуют переключению В-клеток на синтез IgE. IL-5 и GM-CSF — цитокины, обеспечивающие созревание, выживание и хемотаксис эозинофилов. К этой группе также относят HLA-DR (гены молекул II класса МНС) — важные молекулы, участвующие в презентации антигена. Имеющиеся сегодня данные свидетельствуют, что полиморфизм генов интерлейкинов и их рецепторов является важным генетическим фактором возникновения БА и атопии [2, 3].

Гены рецепторных молекул (IL-4Rα, FcεRI β, ADRβ2). IL-4Rα — альфа цепь рецептора IL-4. Mitsuyasu et al. [4] сообщили о полиморфном варианте гена Ile50Val IL-4Rα цепи, наличие которого повышает синтез IgE и является одним из определяющих наследственных факторов возникновения атопической формы заболевания. В 17% случаев замена одного аминокислотного остатка (изолейцина лейцином в позиции 181) в гене, кодирующем β-субъединицу высокоаффинного рецептора к IgE (FcεRI β), приводит к развитию бронхиальной астмы. Однако аналогичные исследования, проведенные в Италии и Японии, такой закономерности не выявили.

Читать еще: Особенности удаления папиллом лазером

Продукт ADRβ2 (гена β2-адренергического рецептора; 11q13) контролирует лабильность бронхов. Установлен полиморфизм гена ADRβ2 (Arg16Gly и Glu27Gln), определяющий повышенную вероятность развития тяжелой бронхиальной астмы. Более того, больные гомозиготные по этим вариантам гена быстро теряют чувствительность к β2-агонистам и требуют лечения гормональными препаратами [5]. Это является одним из достижений в фармакогенетике БА. Причем ген рецептора IL-4 (IL4RA) и ген, кодирующий β-субъединицу высокоаффинного рецептора к IgE (FcεRI β), могут быть отнесены к генам атопии, а ген ADRβ2 — к генам бронхиальной гиперреактивности.

Южнокорейскими учеными [6] выявлены 2 полиморфных гена CRTH2, экспрессирующихся на поверхности эозинофилов, с однонуклеотидными заменами -466T>C и -129C>A, которые тесно связаны с инфильтрацией эозинофилами дыхательных путей у больных с аспирин-индуцированной БА. Гены факторов трaнcкрипции — STAT6, JAK1, JAK3 [7] ассоциированы с наличием БА. Последний мета-анализ объединил результаты 11 исследований [8]. Выявлены хромосомные регионы, содержащие ведущие гены восприимчивости к БА, при использовании самых строгих статистических критериев. К ним относятся 6p22.3-p21.1 (гипеpaктивность бронхов), 5q11.2-q14.3 и 6pter-p22.3 (концентрация общего IgE), 3p22.1-q22.1, и 17p12-q24.3 (положительный кожный тест). Однако никакой преобладающей ассоциации среди указанных регионов не обнаружено, что объясняет гетерогенность болезни и вариабельность диагноза в разных популяциях разных стран.

Признано, что многочисленные гены взаимодействуют между собой при БА и атопии, повышая или уменьшая риск развития болезни. При наличии генов, кодирующих IL-13 и IL-4RA (обе ключевые молекулы в Th-2 сигнализации), выявлен в 2,5 раза больший риск развития БА, чем у индивидуумов с наличием одного гена. Исследование четырех генов показало, что комбинация определенного однонуклеотидного полиморфизма (SNPs) в IL-13, IL-4, IL4RА, и STAT 6 сопровождается 16,8-кратным увеличением риска БА. Эти сведения указывают на значение изучения взаимодействия генов при сложных болезнях и объясняют их роль в развитии и прогрессировании болезни.

Имеется предположение, что эндогенная БА — аутоиммунное заболевание, опосредованное аутоантителами к эпителиальному антигену. Не исключено, что появление аутоантител связано с генетически обусловленным дефицитом антиоксидантной системы. Свободные радикалы способны превращать макромолекулы в аутоантигены. На их возникновение иммунная система отвечает выработкой специфических аутоантител. В организме запускается аутоиммунный процесс, который в конечном итоге и приводит к БА. В этой связи относительно недавно обнаружена субпопуляция T-хелперов, названная Th17 [9], играющая значимую роль при аутоиммунных заболеваниях.

IL-17 является эффекторным цитокином, который продуцируют Th17 клетки, и его повышенная концентрация выявлена в слюне больных БА [10]. Однако имеются исследования [11] о варианте гена IL-17, His161Arg, который ассоциирован с протективным эффектом при астме. В 2009 году обнаружены новые гены восприимчивости к БА, не связанные с иммунной системой. Полиморфизм генов хитиназы и хитиназоподобных белков CHIT1, CHIA, CHI3L1 сочетается с риском БА.

Относительно недавно был охаpaктеризован первый позиционно клонированный ген астмы ADAM33 [12] на хромосоме 20p13. Анализ 135 однонуклеотидных полиморфизмов в 23 из них показал наиболее существенную ассоциацию заболевания с вариантом гена ADAM33, который кодирует металлопротеазу, играющую важную роль в функционировании гладких мышц бронхов и фибробластов легкого. Эти данные свидетельствуют о важной роли ADAM33 в ремоделировании дыхательных путей. В настоящее время роль этих генетических вариаций, связанных с восприимчивостью к астме, подтверждена в Саудовской Аравии, Китае [13]. В локусе хромосомы 1q31 в 2010 году был идентифицирован ген DENND1B, который экспрессируется натуральными киллерами и дендритными клетками, кодирует белок, взаимодействующий с рецептором фактора некроза опухоли, и связан с развитием БА [14].

Гены-модификаторы (GSTM1, GSTT1, CYP2E1, NAT2, SLC11A1). На сегодняшний день известно, что в патологии БА принимают участия белковые продукты генов системы детоксикации ксенобиотиков. Недавними исследованиями Сардарян И.С. [15] изучены фенотипические особенности БА при аллельном полиморфизме генов глутатион-S-трaнcферазы Т1 (GSTT1), глутатион-S-трaнcферазы М1 (GSTM1), ангиотензин превращающего фермента (ACE), эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). Выявлено, что ассоциация генотипов GSTT1-GSTM1‑ повышает в 5 раз риск развития БА у детей по сравнению с популяцией. У детей при функционально активном генотипе GSTT1+GSTM1+ в ассоциации с полиморфизмом II по гену АСЕ риск развития БА снижается в 7 раз, что позволяет считать данную ассоциацию генотипов протективной.

В заключение можно указать, что к развитию астмы причастны много генов, расположенных на разных хромосомах. Прежде всего это генный комплекс HLA на 6-й хромосоме. Кроме того, с развитием БА связаны:

локусы 2 pter*
2q6 (реакция на домашних клещей)
2q33 (CD28; белок, связывающий инсулиноподобный фактор)
3p24.2-p22 (С-С рецептор хемокина)*
4q35 (интерферонорегулирующий фактор-2)*
5q15 (ген не идентифицирован)
5q23-q33 (IL-3; IL-4; IL-5; IL-9; IL-13; глюкокортикоидный рецептор)**
5q31 (гены регуляции IgE). В непосредственной близости расположены гены бронхиальной гиперреактивности и адренергических b2 рецепторов
6p21.1-p23 (HLA, фактор некроза опухолей α)*
7р15.2 (Т-клеточный рецептор G, IL-6)*
9q31.1 (тропомиозин связывающий белок)*
11р15 (ген не идентифицирован)
11q13 (ген b-цепи высоко аффинного IgE рецептора, триггер аллергических реакций на мастоцитах, передается по материнской линии, отцовский «импринтинг» вероятен)**
12q (синтаза оксида азота)
12q14-q24.33 (сигнальный кондуктор и активатор трaнcкрипции 6; интерферон γ; фактор стволовых клеток; инсулин-подобный фактор роста 1; лейкотриен А4 гидролаза; β субъединица ядерного фактора Y; В-клеточный трaнcлокационный ген 1)**
13q14.3-qtep (трaнcляционно контролируемый протеин-1 опухоли)*
16q22.1-q24.2 (ген не идентифицирован)
17p11.1-q11.2 (хемокиновый кластер)
19q13 (CD22)
21q21 (ген не идентифицирован)
Xq28/Yq28 (рецептор IL-9)

* — общие гены с атопией; ** — общие гены с атопией и атопическим дерматитом

Данный перечень генов, ответственных за развитие БА, не полон. Не упомянуты гены, участвующие в ремоделировании дыхательных путей, гетерогенна и гиперреактивность дыхательных путей. Все это делает понятным клинический полиморфизм заболевания.

Будет ли возможно в будущем предсказать развитие БА, базируясь на генетическом тестировании? Предсказующая величина тестирования единственного гена при полигенном наследовании болезни очень ограничена как для диагностики, так и в профилактических целях. В будущем прогноз астмы, возможно, будет основываться на оценке комплекса генов, персональных факторов и факторов риска окружающей среды, вместе содействующих развитию, персистенции, прогрессированию или ремиссии БА [16, 17].

Ю.И. Будчанов, В.М. Делягин

Тверская государственная медицинская академия

Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, oнкoлoгии и иммунологии, г. Москва

Будчанов Юрий Иванович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической иммунологии с аллергологией Тверской государственной медицинской академии.

1. Burr M., Merrett T., Dunstan F., Maguire M. The development of allergy in high-risk children // Clinical and Experimental Allergy, 1997. — v. 27. — Р. 1247-1252.

2. Фрейдин М.Б., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Вклад полиморфизма генов интерлейкинов в изменчивость количественных факторов риска атопической бронхиальной астмы // Мед. генетика, 2003. — Т. 2. — № 3. — С. 130-135.

3. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Генетика атопии: современное состояние. // Вестник ВОГиС, 2006. — Том 10. — № 3 — С. 492-503.

4. Mitsuyasu H., Izuhara K., Mao X.-Q. et al. Ile50Val variants or IL4Ra upregulates IgE synthesis and associates with atopic asthma // Nat. genet., 1998. — v. 19. — Р. 119-120.

5. Wechsler M., Lehman E., Lazarus S. et al. National Heart, Lung and Blood Institute’s Asthma Clinical Research Network. beta-Adrenergic receptor polymorphisms and response to salmeterol //American Journal Respir. Crit. Care Medicine, 2006. — v. 173. — P. 519-526.

6. Palikhe N., Kim S-H., Cho B-Y. et al. Genetic variability in CRTH2 polymorphism increases eotaxin-2 levels in patients with aspirin exacerbated respiratory disease // Allergy, 2010. — v. 65. — Р. 338-346.

7. Moller M., Gravenor M., Roberts S. et al. Genetic haplotypes of Th-2 immune signalling link allergy to enhanced protection to parasitic worms. // Human Molecular Genetics, 2007. — v. 16. — Р. 1828-1836.

Читать еще: Лимфостаз нижних конечностей: лечение, симптомы, причины, фото

8. Denham S., Koppelman G, Blakey J. et al. Meta-аnаlysis of genome-wide linkage studies of asthma and related traits // Respir. Research, 2008. — v. 9. — р. 38.

9. Weaver C., Hatton R., Mangan P., Harrington L. IL-17 family cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages // Annual Revy Immunology, 2007. — 25. — Р. 821-852.

10. Bullens D., Truyen E., Coteur L. et al. IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients: linking T cell driven inflammation and ranulocytic influx? // Respir. Res., 2006. — v. 7. — Р. 135.

11. Kawaguchi M., Takahashi D., Hizawa N. et al. IL-17F sequence variant (His161Arg) is associated with protection against asthma and antagonizes wild-type IL-17F activity // Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006. — v. 117. — Р. 795-801.

12. Van Eerdewegh P., Little R., Dupuis J. et al. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness // Nature, 2002. — v. 418. — Р. 426-430.

13. Bazzi M., Al-Anazi M., Al-Tassan N.A. et al. Genetic variations of ADAM33 in normal versus asthmatic Saudi patients // http://biotechcentersa.org/asthma-genetics/.

14. Sleiman P., Flory J., Imielinski M. et al. Variants of DENND1B associated with asthma in children // New England Journal of Medicine, 2010. — v. 362. — Р. 36-44.

15. Сардарян И.С. Фенотипические особенности бронхиальной астмы у детей при различных аллельных полиморфизмах генов «предрасположенности» (GSTТ1, GSTМ1, ACE, eNOS) / Автореф. дисс. к.м.н. — СПб, 2009. — 22 с.

16. Koppelman G., te Meerman G., Postma D. Genetic testing for asthma // Eur. Respir. J., 2008. — v. 32. — Р. 775-782.

17. Postma D., Koppelman G. Genetics of asthma: where are we and where do we go? // The Proceedings of the American Thoracic Society, 2009. — v. 6. — Р. 283-287.

Лечение астмы на генетическом уровне

Russel Hopp, MD

Генетика астмы

Академия иммунологии США

Проявления астмы в фенотипе

Поиск генов

Геномные исследования

Структурные вариации генов

Заключение

Перевод с английского Натальи Байч

Генетическое профилирование метилирования слизистой бронхиальной астмы: отношение к атопии

Астма является распространенным респираторным заболеванием, которое хаpaктеризуется гиперреактивностью бронхов и обструкцией дыхательных путей вследствие хронического воспаления дыхательных путей. Атопическая астма является типичным IgE-опосредованным заболеванием, в котором усиленное продуцирование IgE обусловлено активацией Th2-клеток, которые выделяют четкую картину цитокинов, включая интерлейкин 4 (IL4) и IL3, в ответ на специфическое представление антигена. Оценить статус метилирования целых геномов тканей слизистой бронхов у субъектов, которым не хватало или было сенсибилизировать Dermatophagoides farina (Df) и Dermatophagoides pteronyssinus (Dp).

Уровни метилирования ДНК генома в тканях бронхиальной слизистой оболочки атопических астматиков (N = 10), неатопических астматиках (N = 7) и нормальном контроле (N = 7) были исследованы с использованием микрочипов.

В слизистой оболочке бронхиальной артерии атопических астматиков гиперметилирование было обнаружено у 6 локусов в 6 генах, тогда как гипометилирование было обнаружено у 49 локусов в 48 генах по сравнению с неатопическими астматиками. Гены, которым были назначены онтологии многоклеточного организменного процесса, реакция на органическое вещество, гормональный метаболический процесс и связывание рецептора фактора роста, были гипометилированы. Уровни метилирования в слизистой оболочке астматиков и нормальный контроль были схожими.

Бледная слизистая оболочка астматиков, которые являются атопическими по отношению к Df или Dp, имеют хаpaктерные образцы метилирования для 52 генов. Гены и пути, идентифицированные в настоящем исследовании, могут быть связаны с наличием атопии в астматиках и, следовательно, представляют собой привлекательные цели для будущих исследований.

Астма является распространенным респираторным заболеванием, которое хаpaктеризуется гиперреактивностью бронхов и обструкцией дыхательных путей вследствие хронического воспаления дыхательных путей [1]. Эти процессы объясняются повышенной экспрессией генов для нескольких воспалительных и иммунных медиаторов, включая цитокины, хемокины, молекулы адгезии, ферменты и химические медиаторы [2]. Комплексные черты, возникающие в результате взаимодействия между множественными факторами восприимчивости к болезням и окружающей средой, оказывают большое влияние на начало и тяжесть астмы [3].

Читать еще: Алкоголь — одна из причин oнкoлoгических заболеваний, так ли это?

Атопическая астма является типичным IgE-опосредованным заболеванием, в котором усиленное продуцирование IgE обусловлено активацией Th2-клеток, которые выделяют четкую картину цитокинов, включая интерлейкин 4 (IL4) и IL3, в ответ на специфическое представление антигена [4 , 5]. Atopy, который хаpaктеризуется наличием IgE, специфичным для ингаляционных аллергенов, или высокоуровневым продуцированием IgE, тесно связан с развитием астмы [6]. Распространенность астмы увеличилась во всем мире за последние три десятилетия [7]. Однако среди популяций одних и тех же расчётов были отмечены широкие различия, свидетельствующие о различном воздействии факторов окружающей среды [8]. Факторами окружающей среды для астмы являются факторы окружающей среды в период до и после родов, включая степень аллергенов, таких как ожирение и воздействие курения и загрязнителей воздуха. Кроме того, астма активируется и усугубляется наружными аллергенами и загрязнителями воздуха, включая пыльцу, и микробные и вирусные патогены [9-11]. Стоит отметить, что многие из этих внутренних и наружных индукторов / триггеров астмы программируют незрелые дыхательные пути в течение ранней жизни без какого-либо влияния на ДНК хозяина, что приводит к изменению риска астмы в более поздней жизни [12]. Эпигенетика состоит из изменений экспрессии генов за счет механизмов, отличных от изменений в лежащей в основе последовательности ДНК [13,14]. Эти изменения могут вызывать фенотипические изменения и сохраняться через клеточные деления на оставшуюся часть жизни клетки, возможно, продолжающуюся в течение нескольких поколений без какого-либо изменения внутренней ДНК-последовательности организма. Эпигенетические изменения включают деацетилирование гистонов, метилирование ДНК и некодирующие РНК. Метилирование ДНК представляет собой ковалентное присоединение метильной группы к остатку цитозина в CpG-динуклеотиде [15]. Регионы метилированной ДНК коррелировали с тканеспецифической экспрессией нескольких генов и с активными кодирующими областями по всему геному [16]. Недавно было показано переходное метилирование для специфических регуляторных областей гена [17]. Анализ метилирования ДНК может быть сгруппирован во взаимоисключающие категории аннотированных промоторов (15%), нетрaнcлируемых областей (UTRs, 7%), экзонов (13%), интронов (31%) и межгенных сегментов (34%) в соответствии с каждым регионов [18]. Однако глобальное распределение метилирования ДНК в тканях слизистой оболочки бронхов человека неизвестно, и его роль в развитии астмы до сих пор не сообщается.

Воспаление и ремоделирование дыхательных путей, которые возникают при астме, хаpaктеризуются инфильтрацией лимфоцитов и эозинофилов в слизистую бронхию, сопровождающимися структурными изменениями, которые включают эпителиальное десквамацию, субэпителиальный фиброз, гиперплазию слизистой оболочки, модификацию внеклеточного матрикса и гипертрофию / гиперплазию клеток гладкой мускулатуры [19,20]. Таким образом, ткани слизистой бронхов подходят для изучения роли эпигенетики в реакциях дыхательных путей на факторы окружающей среды, такие как внутренние аллергены. В настоящем исследовании с использованием микрочиповых анализов мы проанализировали профили метилирования ДНК в геноме тканей слизистой оболочки бронхов из двух групп астматиков, которым не хватало или нести специфический IgE для пылевых клещей Dermatophagoides farina (Df) и Dermatophagoides pteronyssinus (Dp), и от нормального контроля, чтобы выявить эпигенетические различия между домашними пылевидными клещи-сенсибилизированными субъектами и наивными субъектами.

Все образцы были получены после получения информированного письменного согласия от каждого пациента, и протокол был одобрен местным этическим комитетом (номер одобрения комитета по этике: SCHBC-IRB-2005-02). Из биобанка были получены ткани слизистой бронхов из атопических астматиков для Df и Dp (N = 10), неатопические астматики (N = 7) и нормальный контроль (N = 7) после того, как экспериментальный протокол был одобрен Этическим комитетом в биобанке Университетской больницы Суончуньчян (Schbc-biobank-2011-004). Все пациенты были диагностированы врачами и соответствовали определению астмы, предусмотренным в руководящих принципах Глобальной инициативы по борьбе с астмой (GINA) [1]. У всех пациентов была история одышки и свистящее дыхание в течение предыдущих 12 месяцев, плюс одно из следующего: 1)> увеличение на 15% объема принудительного выдоха за 1 секунду (FEV1) или увеличение на 12% плюс 200 мл после ингаляции короткого -действующий бронходилататор; 2) увеличение на 20% FEV1 после 2 недель лечения ингаляционными или системными кортикостероидами. Обычные испытуемые, которые были набраны у супругов пациентов и из общего населения, отрицательно ответили на скрининговую анкету для респираторных симптомов [21] и имели FEV1> 75% от прогнозируемого значения, метахолин РС20> 10 мг / мл , и нормальные находки на рентгенограмме простого сундука.

Тесты на аллергию на кожу проводили с использованием 24 коммерческих ингаляционных аллергенов, которые включали пылевые клещи (Df и Dp), грибы, кошачий мех, собачий мех, таpaканы и траву, дерево и пыльцу сорняков (Bencard Co. Ltd., Brentford, UK ). Все тесты включали положительный (1 мг / мл гистамин) и отрицательный (разбавитель). Атопию определяли как имеющую волнообразную реакцию, равную или превышающую 3 мм в диаметре, или равную или большую, чем та, которая индуцируется гистамином. IgE, специфичный для Df и Dp, измеряли с использованием системы CAP (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden). Концентрации были измерены в кУ / л и выражены полуколичественно как классы 0-6. Сенсибилизация клеточных пылевых клещей была подтверждена положительным испытанием на кожный покров для размещения пылевых клещей и повышенным уровнем IgE, специфичным для аллергенов (выше, чем оценка 2). Non-atopy определяли как отрицательный тест кожного укола для всех тестируемых аллергенов и отрицательный результат для конкретного IgE (оценка 0), выращенного в ответ на Df и Dp.

Все биопсии слизистой были взяты из сегментных килей правой нижней доли, закрепленных в 4% -ном буферированном растворе формальдегида и встроенных в парафиновые блоки. ДНК очищали из тканей с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Crawley, UK).

Бисульфитную конверсию геномной ДНК проводили с помощью набора метилирования ДНК EZ (Zymo Research, Irvine, CA, USA), следуя протоколу производителя с модификациями для анализа метилирования Illumina Infinium. Вкратце, один микрограмм геномной ДНК сначала смешивали с 5 мкл буфера для M-Dilution и инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут, а затем смешивали с 100 мкл CT Conversion Reagent, подготовленного в соответствии с инструкцией в протоколе. Смеси инкубировали в термоциклере в течение 16 циклов при 95 ° С в течение 30 секунд и 50 ° С в течение 60 минут. Образцы ДНК, обработанные бисульфитом, загружали на 96-колонные планшеты, предусмотренные в наборе для десульфирования и очистки, как указано в протоколе.

Образованную бисульфитом геномную ДНК анализировали с использованием метилирования человека27 Beadchip (Illumina, San Diego, CA, USA). Биадчип содержит 27 578 CpG локусов, охватывающих более 14 000 человеческих генов RefSeq при однонуклеотидном разрешении. Чип-процесс и анализ данных выполнялись с использованием реагентов, представленных в комплекте, и следуя инструкциям производителя. Вкратце, 4 мкл превращенной в бисульфит геномной ДНК денатурировали в 0,014 N гидроксида натрия, нейтрализовали и амплифицировали реагентами, снабженными набором, и буфером в течение 20-24 часов при 37 ° C. Образцы были фрагментированы. 12 мкл каждого образца загружали в микросхему с 12 образцами, и чипы собирали в гибридизационную камеру, как указано в руководстве. После инкубации при 48 ° С в течение 16-20 часов чипсы промывали промывочными буферами, поставляемыми в комплекте, и собирали и помещали в проточную проточную систему для реакции удлинения праймера и окрашивали реагентами и буферами, предусмотренными в комплекте. Чипсы с полимерным покрытием были обработаны изображениями в сканере iScan компании Illumina. Данные были извлечены с использованием программного обеспечения GenomeStudio. Значения метилирования для каждого локуса CpG выражают в виде бета (β) -значения, представляя непрерывное измерение от 0 (полностью неметилированное) до 1 (полностью метилированное). Это значение основано на следующем определении и вычислении: β-value = (интенсивность сигнала зонда обнаружения метилирования) / (интенсивность сигнала зонда обнаружения метилирования + интенсивность сигнала зонда обнаружения неиметирования). Данные интенсивности были нормированы с использованием фоновой функции.

Чтобы идентифицировать дифференцированные метилированные CpG-сайты между группами, разность средних уровней метилирования между двумя группами была проанализирована с использованием двухстороннего t-теста. Предполагая нормальное распределение β-значения, DeltaBeta (| Δβ |) рассчитывали как β для группы бронхиальной астмы (BA) минус, что для группы нормального контроля (NC) или атопических астматиков минус, что для неатопических. Выбор дифференциально-метилированных локусов CpG между группами основывался на (1) разности β-значений> 0,10 и (2) P-значение