Длительное культивирование эмбрионов in vitro

Длительное культивирование эмбрионов in vitro (LTC-BS — Long Term Cultivation to Blastocyst Stage) представляет собой процесс, основной целью которого является поддержание нормального развития и жизнеспособности в целом эмбрионов, перед посадкой их в маточную полость при ЭКО. Данный процесс достаточно короткий по времени и занимает всего 6 суток. После этого эмбрион должен быть посажен в матку для закрепления в эндометрии.

Что собой представляет подобного рода процедypa?

Длительное культивирование эмбрионов по своей сути является высокотехнологичным и достаточно сложным процессом, который требует специальной, хорошо оборудованной лаборатории и дорогостоящей аппаратуры. Именно в виду данной особенности, далеко не все центры, занимающиеся проведением ЭКО и планированием беременности, предоставляют подобного рода процедуру.

Данный метод предполагает культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты. Ранее использовавшиеся методики предполагали пересадку зародыша в организм женщины еще на стадии его дробления, т.е. через 2-3 дня. Этот факт резко снижал успешность ЭКО и процедуры переноса эмбриона приходилось повторять неоднократно.

Переход к культивированию эмбрионов in vitro стал возможен технологическому прорыву в области эмбриологии, благодаря специальным разработкам в области репродуктивной медицины. На данный метод, используемый в ведущих репродуктивных клиниках мира, предполагает более длительный контакт с эмбрионом особых сред (SICM/SIBM и Embryo Assist/Blast Assist).

Также стоит отметить, что данная методика не могла бы существовать без использования специального устройства – мультигазового инкубатора. Именно в него помещается несколько зигот вместе с питательной средой. По прошествии 4-6 суток специалисты извлекают бластоцисту из данного устройства и оценивают ее жизнеспособность. Согласно статистических данных, примерно из 60-70% яйцеклеток, оплодотворенных при проведении ЭКО, возможно получить нормальные эмбрионы.

В чем плюсы длительного культивирования эмбрионов?

Данный метод проведения ЭКО позволяет, в первую очередь улучшить качество селекции (отбора) и использовать для пересадки только эмбрионы, имеющие достаточно высокий, так называемый потенциал имплантации. Говоря простыми словами, — применение данного метода намного увеличило вероятность наступления беременности после проведения ЭКО.

Кроме этого, среди других преимуществ длительного культивирования эмбрионов обычно называют:

уменьшение количества хромосомных аномалий у эмбрионов, пересаживаемых на стадии бластоцисты;
данный метод более физиологичный по сравнению с переносом эмбрионом до 3 дня;
при длительном культивировании достаточно помещать в полость матки 1-2 эмбриона, т.к. вероятность их закрепления и развития очень высока;
значительно снижается риск развития такого осложнения, как внематочная беременность.

Каковы недостатки данного метода?

Разобравшись с тем, что это такое длительное культивирование пoлoвых клеток (гамет) и эмбрионов, рассказав о преимуществах такого метода проведения ЭКО, необходимо не забывать и о недостатках данного способа.

Первым из них является тот факт, что далеко не все культивируемые эмбрионы дорастают до бластоцисты, — в большинстве случаев только лишь 50% их достигает данной стадии развития. Учитывая данную особенность, проведение данного метода возможно лишь в том случае, если к 3 дню выращивания эмбрионов, их останется не менее 4. При меньшем числе вероятность получения хотя бы одного нормального, дошедшего до стадии бластоцисты, очень низка.

Вторым недостатком можно назвать тот момент, что даже если эмбрион достигает необходимой для пересадки стадии развития, это не дает 100% гарантии, что имплантация пройдет успешно и беременность наступит.

LTC-BS — длительное культивирование эмбрионов

Самый прогрессивный и эффективный подход в культивировании эмбрионов. Позволяет достичь максимальной частоты наступления беременности.

пар в России нуждаются в лечении методом ЭКО.

Частота наступления беременности в Клинике МАМА.

малышей уже родились в результате лечения в Клинике МАМА!

LTC-BS — Long Term Cultivation to Blastocyst Stage (в переводе с англ. – «длительное культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты»).

Культивирование эмбрионов in vitro (от лат. «в пробирке») — это поддержание нормального развития и жизнеспособности эмбрионов человека вне организма матери. Это становится возможным благодаря созданию в эмбриологической лаборатории условий для развития эмбрионов, максимально приближенных к условиям естественной материнской среды. При этом культивирование эмбрионов in vitro возможно только до определенной стадии развития — пока у эмбриона еще отсутствует непосредственная связь с организмом матери, то есть первые 6 суток после оплодотворения.

Длительное культивирование эмбрионов — сложный и высокотехнологичный процесс, требующий особого технического оснащения лаборатории и профессионализма эмбриологов. Преимущества культивирования до стадии бластоцисты перед культивированием до стадий дробления (первые 2–3 дня развития) уже признаны большинством специалистов-эмбриологов. Самые авторитетные эмбриологические лаборатории мира пpaктикуют культивирование эмбрионов именно до 4–6 суток развития независимо от количества полученных яйцеклеток. В клинике МАМА перенос эмбрионов осуществляют обычно на 5–6-е сутки развития, именно на стадии бластоцисты (в некоторых случаях бластоциста может сформироваться уже на 4 сутки после оплодотворения).

Переход к схеме длительного культивирования эмбрионов in vitro во всем мире стал возможен благодаря научному прорыву в сфере высокотехнологичных разработок репродуктивной медицины, а именно переходу к новым системам культивирования, специально созданным для более длительного периода контакта с эмбрионом.

В клинике МАМА для культивирования эмбрионов используют среды последнего поколения: SICM / SIBM и Embryo Assist / Blast Assist всемирно известных производителей, компаний Cook и Medi-Cult.

Еще одно важнейшее научно-технологическое достижение, способствовавшее развитию системы длительного культивирования эмбрионов in vitro, — мультигазовый инкубатор. Эмбриологическая лаборатория клиники МАМА оснащена современными мультигазовыми инкубаторами марок Galaxy и Sanyo. Показатели инкубаторов (содержание CO2, O2, N2, температура, давление газа в системе) находятся под непрерывным компьютерным мониторингом, что гарантирует стабильность и надежность всей системы культивирования.

Клиника МАМА пpaктикует культивирование эмбрионов до 4–6 суток развития и перенос на стадии бластоцисты с 2003 года. За это время нами накоплен огромный опыт как в пpaктических подходах культивирования, так и в выборе наиболее перспективных эмбрионов для переноса и криоконсервации. Это помогло нам достичь большей частоты наступления беременности, повысить эффективность криопротоколов и усовершенствовать тактику ведения повторных протоколов.

Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Зозуля Ю. А., Лисяный Н. И., Любич Л. Д., Грищенко В. И., Петренко А. Ю., Бабийчук Г. А.

При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в бессывороточную среду ДМЕМ происходит сокращение их количества в 3–4 раза до 9-х суток культивирования, после чего содержание клеток стабилизируется, что свидетельствует о наличии в культуре популяции самоподдерживающихся стволовых клеток. Добавление в среду дополнительных факторов ( ретинола ацетата ) способствует пролиферации нейроклеток-предшественников. Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получить обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro.

The long-term cultivation in vitro of the cryopreserved and native nerve cells of human embryo

The long-term cultivation in vitro of neuroprecursors in DMEM without serum lead to the 3–4-fold decrease of the number of cells on the 9-th day of cultivation. Then the number of cells become consistent evidencing about the presence in culture of self-renewing population of stem cells. Retinolacetate stimulate the proliferation of precursors. The method of long-term cultivation of human nerve cells allow to get the enriched population of neuroprecursors with capacity to proliferation in vitro.

Читать еще: Рентгенологическое исследование костей таза

Текст научной работы на тему «Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека»

Украгнсъкий нейрох1рург1чний журнал, №2, 2003

Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных нейроклеток эмбрионов человека

Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Бабийчук Г.А.

Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г.Киев Институт криобиологии и криомедицины АН Украины, г.Харьков

При длительном культивировании in vitro нейроклеток-предшественников в бессывороточную среду ДМЕМ происходит сокращение их количества в 3-4 раза до 9-х суток культивирования, после чего содержание клеток стабилизируется, что свидетельствует о наличии в культуре популяции самоподдерживающихся стволовых клеток. Добавление в среду дополнительных факторов (ретинола ацетата) способствует пролиферации нейроклеток-предшественников. Разработанная методика длительного культивирования нейроклеток человека позволяет получить обогащенную популяцию нейроклеток-предшественников, способных к пролиферации in vitro. Ключевые слова: нервные стволовые клетки, предшественники нейроклеток, суспензионные кулъ-туры, ретинола ацетат.

Введение. Нервные стволовые клетки (НСК) рассматриваются как многообещающие источники для клеточной и генной терапии заболеваний нервной системы, благодаря своей способности дифференцироваться во все клеточные типы структур нервной системы. В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на проблемах идентификации, выделения, размножения и сохранения НСК и изучения их дифференцировки в культуре и при трaнcплантации в мозг.

На долю стволовых клеток приходится не более 0,1-0,01% клеток всей клеточной массы органа (в головном мозге и печени насчитывается примерно по 10 млрд. клеток, в иммунной системе — 300 млрд.) [4]. В отличие от мозга взрослых особей мозг эмбрионов человека I триместра беременности на 90% состоит из эмбриональных стволовых и прогениторных клеток [6]. Даже в постнатальном мозге человека и млекопитающих присутствуют два пула проге-ниторных нейробластов, способных повторно интегрироваться в нейронные сети эмбриона после экспериментальной трaнcплантации. Стволовые и мультипотентные клетки присутствуют в герминативных областях (паравентрику-лярной и субэпендимарной зонах) мозга не только в эмбриональном и раннем постнатальном периоде онтогенеза, но и в течение всей жизни млекопитающих и человека.

Разработаны несколько способов получения региональных стволовых клеток нервной ткани в культуре клеток [8, 9, 10]. Общий принцип заключается в том, что при добавлении ростовых факторов в специально подобранную культуру происходит деление стволовых клеток, тогда как убирая ростовые факторы, длительно культивируя и добавляя индукторы клеточной дифференцировки, можно получить обогащенную культуру нейробластов. Цитодиф-ференцировка нейробластов сопровождается образованием агрегатов клеток с формированием нейритов, аксонов и специфических межклеточных контактов [1, 2, 7]. Значительная часть стволовых прогениторных клеток в условиях такого культивирования погибает, остальные приспосабливаются к условиям среды и длительное время переживают в культуре клеток.

Целью данного исследования явилось изучение влияния условий культивирования на динамику переживания нейроклеток-предше-ственников, полученных из различных источников, при длительном культивировании in vitro в бессывороточной среде ДМЕМ.

Материалы и методы. Материалом исследований служили: 1) криоконсервированные нейроклетки человека 7, 8, 9, 10, 11-12 нед гестации, полученные из банка клеток Института криобиологии и криомедицины АН Укра-

Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Баббийчук Г.А.

ины (г.Харьков) ; 2) нейроклетки человека из нативного aбopтивного материала (табл.1).

Получение суспензионных культур клеток-предшественников. Запечатанные контейнеры с криоконсервированными клетками извлекали из жидкого азота, помещали в водяную баню

Таблица 1 Сфнн экспериментальных наблюдений

Манфют Сфня Ц> о дал^мтальнос ть кулынгаро*ання, сут

Криоюнсервиро ванные нейроклетки человека. (7-12 нед гестации), п=14 1 21^18

Нейро кпв тки человека из нативного aбopтивного материала (3-12 нед гестации), п. =4 2 21

для оттаивания при температуре 38-40°С. Затем клетки переносили в стеклянные флаконы со средой ДМЕМ. Каждых 3 дня половина куль-туральной среды обновлялась.

Нативную эмбриональную мозговую ткань переносили в раствор ОМЕ или изотонический раствор натрия хлорида, освобождали от оболочек, помещали в среду ДМЕМ и суспендировали с помощью шприца с толстой иглой. Отстаивали 3 мин и надосадок переносили в стеклянные флаконы и чашки Петри. Каждых 3 дня половина культуральной среды обновлялась.

Изучение кинетики популяции клеток проводили путем тщательного суспендирования и отбора образцов клеточной взвеси из культу-рального объема. Определяли количество и жизнеспособность клеток согласно рекомендациям [5] по исключению трипанового синего.

Изучение влияния состава культуральной среды на переживаемость предшественников нервных клеток осуществляли в бессывороточной среде ДМЕМ и при добавлении в культу-ральную среду ретинола ацетата (0,2 мг/мл, АО «Киевский витаминный завод»).

Результаты и их обсуждение. Кинетика суспензионных культур предшественников нейроклеток при культивировании в среде ДМЕМ представлена в табл.2 (данные приведены в процентном выражении от первона-

чального количества клеток, внесенных в питательную среду).

Как видно из табл.2, при культивировании нейроклеток человека 8-12 нед гестации в бессывороточной среде ДМЕМ происходило снижение количества клеток. На 5-7-е сутки культивирования количество клеток снизилось в 1,52 раза; на 9-е сутки — в 3-4 раза, в дальнейшем в культуре сохранялась тенденция к снижению количества клеток.

Кинетика суспензионных культур криокон-сервированных нейроклеток человека 8-12 нед гестации представлена на рис.1 и в табл.3., из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, на 9-е сутки культивирования снижалось в 5 раз по сравнению с первоначальным их количеством и продолжало снижаться до конца наблюдения (19-е сутки). При культивировании клеток в среде ДМЕМ+рети-нола ацетат, который вводили в питательную среду на 5-е сутки, значительного снижения количества клеток в культуре не происходило, их количество начинало возрастать с 7-х суток культивирования и увеличивалось на 9-12-е сутки культивирования в 2 раза и больше, достигая исходного количества клеток. По мере увеличения срока культивирования количество жизнеспособных клеток возрастало. При этом количество клеток, культивируемых в среде ДМЕМ+ретинола ацетат, превышало содержание клеток, помещенных в среду ДМЕМ, в 3-4 раза на 5-7-е сутки (от начала добавления ретинола ацетата) и в 9 раз — на 14-е сутки. Таким образом, добавление в культуральную среду ретинола ацетата значительно увеличивало выживание и размножение нейрогенных клеток.

Кинетика суспензионных культур нативных нейроклеток человека 8-12 нед гестации (aбopтивный материал) представлена на рис.2 и в табл.4, из которых видно, что количество клеток, помещенных в среду ДМЕМ, снижалось в 3 раза на 9-е сутки культивирования по сравнению с первоначальным количеством, а на 19-е сутки — в 5 раз. При добавлении в среду ДМЕМ ретинола ацетата исходное содержание клеток сохранялось и несколько возрастало с

Читать еще: Отрицательное влияние формальдегида на организм и симптомы отравления

Таблица 2. Динамика количества клеток-предшественников в суспензионной культуре в бессывороточной среде ДМЕМ, %

Источник клеток Продолжительность культивирования, сутки

0 1-е 3-и 5-е 7-е 9-е 12-е 19-е

Криоконсерви-рованные нейроклетки человека, п=14 100,00±0,00 89,23±6,11 80,53±13,93 63,76±10,86* 50,20±12,40* 24,07±8,44* 35,29±7,34* 11,50±6,40*

Нативные нейроклетки человека, п=4 100,00±0,00 — — 58,10±14,83* — 30,94±11,76* 43,98±19,37* 22,43±10,19*

— различия достоверны по сравнению с показателем 0 сут культивирования (Р

Культивирование эмбрионов — выращивание «в пробирке»

Культивирование эмбрионов является важным этапом процедуры ЭКО. От того, насколько успешно он пройдет, зависит последующая имплантация эмбриона. Технологии культивации постоянно совершенствуются, при этом особое внимание уделяется питательным средам. Современные препараты максимально близки по составу к естественным условиям материнского организма.

Что такое культивирование эмбриона?

Культивированием эмбрионов называют процесс создания условий для оплодотворения яйцеклетки и ее дальнейшего развития. Все этапы происходят в лабораторных условиях: в специальной среде, имеющей состав пpaктически такой же, как жидкость в матке и фaллoпиевых трубах.

Начало культивирования эмбрионов происходит через сутки после извлечения фолликулов из организма женщины. Эмбриолог оценивает наступление оплодотворения и устанавливает предположительную дату переноса материала в матку.

Чем больше экземпляров развивается нормально, тем дольше время их культивирования. В процессе развития специалист может определить, какие из них наиболее жизнеспособны. Отбор позволяет повысить шансы успешной имплантации. Подробнее о имплантации эмбриона при ЭКО→

Длительное культивирование эмбрионов – одна из последних разработок в этой области науки. Суть этой процедуры в том, что выращивание продолжается в течение 5-ти суток до стадии бластоцист с высокой способностью к закреплению на стенке матки. Возможность достичь такого уровня развития появилась благодаря разработке специальных субстанций, имитирующих микросреды женского организма.

Питательные среды для выращивания эмбрионов разpaбатываются с 1912 года. Вначале они представляли собой физиологический раствор соли. Более века состав этих субстанций совершенствовался. В 1985 году ведение в них альбумина – источника аминокислот – стало серьезным прорывом и позволило выращивать эмбрионы до 2-3 суток.

Эта среда получила название Human Tubal Fluid. Дальнейшие исследования показали, что развитие оплодотворенной яйцеклетки происходит не в одной и той же субстанции, а в разных. Это привело к созданию двухступенчатых сред, которые используются в настоящее время.

Последняя разработка, улучшающая качество процедуры – культивирование эмбрионов в среде ЭмбриоГен. Она содержит GM-CSF — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, который в большой концентрации присутствует в матке до и во время прикрепления к стенке эмбриона, а также в течение свей беременности. У женщин с бесплодием он пpaктически отсутствует.

Среда ЭмбриоГен повышает качество и жизнеспособность переносимого при ЭКО материала, увеличивает вероятность успешной имплантации и последующего вынашивания плода. Она незаменима для пациенток, у которых уже были неудачные попытки искусственного оплодотворения, и в тех случаях, когда удается произвести забор всего одной или двух яйцеклеток.

Культивирование эмбрионов начинается на следующий день после пункции с забором яйцеклеток и их оплодотворения. Выращивание проходит в несколько этапов:

Этап зрелой яйцеклетки – 1-й день. Эмбриолог оценивает успешность оплодотворения, отделяет некачественный материал. Эта стадия пронуклеусов. Перенос пpaктически не пpaктикуется, но можно криконсервировать клетки.
Этап оплодотворенной яйцеклетки с двумя пронуклеусами – 2-й день. К этому времени образуется зигота (слияние мужского и женского генома), происходит первое дробление. Яйцеклетка становится эмбрионом. Оценивается его качество по степени фрагментации, форме и размерам бластомеров.
Этап 4-клеточного эмбриона – 3-й день. Чаще всего к этому времени эмбрион представляет собой 6 или 8 бластомеров. Происходит активация собственного генома, от того насколько она успешна и своевременна зависят дальнейшие этапы культивирования. Когда в наборе хромосом есть ошибки, развитие останавливается («блок развития in vitro»).
Этап 8-клеточного эмбриона – 4-й день. Начало стадии морулы: прострaнcтва между клеток уплотняются, поверхность становится более сглаженной. Эмбрион к этому времени состоит из 10-16 бластоцист. К завершению 4-го дня в моруле появляется полость – начало кавитации.
Этап компактной морулы – 5-й и 6-й день. Объем полости занимает половину всей морулы — эмбрион становится бластоцистой. Он состоит из внутренней клеточной массы и трофобласта, который обеспечивает имплантацию.

Преимущества и недостатки каждого этапа культивирования

В каждых сутках культивирования есть положительные и отрицательные моменты для переноса эмбриона в организм женщины:

1 сутки. Преимущества столь короткого срока в том, что потенциальное вредное воздействие условий культивирования минимально. Проблемы переноса в матку связаны с тем, что физиологически в это время эмбрион должен находиться в фaллoпиевой трубе (не в матке). К тому же, трудно оценить его качество.
2 сутки. Плюсы в том, что эмбрион недолго находится вне естественной среды и уже можно сделать первичный отбор качественных экземпляров, так как началось дробление. Минусы: еще нет возможности отделить эмбрионы с нарушениями генома, нельзя провести преимплантационную генетическую диагностику.
3 сутки. Положительный момент в том, что можно отделить эмбрионы, которые отстают в развитии или вовсе его прекратили. Недостатки такие же, как и на 2 сутки.
4 сутки. Положительный момент этого срока в том, что эмбрион достиг стадии, на которой происходит его перемещение из фaллoпиевой трубы в матку, то есть введение его в полость будет близко к физиологическому. Столь длительное культивирование эмбрионов «in vitro» способствует преодолению «блока развития» – остановки дробления «в пробирке (стекле)». На этом сроке уже можно выполнить преимплантационную генетическую диагностику (ПГД). Недостаток: сложно оценить качество морул.
5 сутки. На этом сроке в 2 раза повышается вероятность имплантации бластоцист в сравнении с двух- или трехдневными эмбрионами. Произошел отбор наиболее сильных и качественных экземпляров, ими пережит «блок развития» «in vitro», можно выполнить ПГД, оценить качество бластоцист. Минусом можно назвать то, что если все эмбрионы остановились на более ранних стадиях, пациентки испытывают сильный стресс, переживают утрату возможности забеременеть.

Побочные эффекты

При проведении процедуры ЭКО не все яйцеклетки становятся эмбрионами. Согласно статистике, этот показатель достигает в среднем 60-70% при стандартном оплодотворении и 80-90% при интрацитоплазматической инъекции cпepматозоида в яйцеклетку.

До стадии бластоцисты, готовой к пересадке в матку, развивается около 40% эмбрионов. И это средние показатели, на пpaктике встречаются случаи с более низкой вероятностью успеха.

Культивирование эмбрионов «in vitro» происходит при постоянной оценке качества экземпляров эмбриологом. Долгое время среды для развития позволяли выращивать оплодотворенную яйцеклетку не более 3-х суток. Можно было получить большее количество материала, но не было возможности точно оценить их жизнеспособность.

С появлением двухступенчатых сред стало доступным длительное культивирование – до 5-6 суток. Стало проще выявлять качественные экземпляры, но их количество уменьшилось. Появился риск, что к 4-5 дню не останется ни одного эмбриона. При этом невозможно установить, что именно привело к остановке их развития: неидеальные искусственные условия выращивания или генетические нарушения.

Читать еще: Разница между бубликом и бapaнкой

Культивированием эмбрионов называют процесс наблюдения за их развитием, отбора наиболее жизнестойких экземпляров и определение наиболее благоприятного дня для их переноса в полость матки. Благодаря развитию сред для выращивания эта процедypa может длиться до 4-6 дней. К концу этого срока успешная имплантация эмбриона наиболее вероятна в большинстве клинических случаев.

Автор: Ольга Ханова, врач, специально для Mama66.ru

25.03.2019 admin Комментарии Нет комментариев

В течение последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в развитых странах Запада.

Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU-Ovum Pick-Up), созревания ооцитов (IVM–in vitro maturation) ; оплодотворения (IVF–in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC – in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трaнc вaгинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Оплодотворение яйцеклеток является наиболее важным этапом, определяющим успех и результативность получения эмбрионов методом in vitro. Традиционно при производстве эмбрионов методом in vitro в технологии оплодотворения используется криоконсервированное семя быков производителей. При этом в случае эмбриопересадки и наступлении стельности пол будущего телёнка неизвестен, это может быть либо бычок либо тёлочка. В молочном скотоводстве получение тёлочек с высокой продуктивностью наиболее важно.

Получение разделённых по полу эмбрионов это перспек- тивный метод, позволяющий получать особей жательного пола, в зависимости от производственной специфики хозяйства. Для полчения разделён ных по полу эмбрионов КРС в технологии оплодотворения используется ceкcированное семя быков. Однако данный метод недостаточно распространён. Ввиду ряда причин:

• низкая концентрация cпepматозоидов в cпepмодозе, порядка 3,5 млн;

• низкий выход полноценных для оплодотворения cпepмиев при использовании метода (swim-up) ;

• высокая стоимость одной cпepмодозы.

В связи с этим перед нами стояла задача разработки наиболее оптимального протоколла оплодотворения яйцеклеток ceкcированной cпepмой, а также подбор культуральной системы позволяющей получать наилучшие условия для развития доимплотированных эмбрионов. Отработка данной технологии осуществлялась на базе производственной лаборатории «Центра по трaнcплантации эмбрионов КРС» ООО «Бетагран- Липецк».

Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (трaнc вaгинальной аспирации). После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25 mM) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД/мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0 мкг/мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг/ мл гентамицина.

Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания объёмом 500 мкл под минеральным маслом (“Sigma”, США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5% CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайетах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре +37ºС в течение 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фpaкции cпepматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. В результате проведённых нами опытов было установленно, что выход подвижных cпepматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл и инкубировались совместно со cпepматозоидами в течение 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содер- жанием 5% CO2 .

После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пипетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом (Sigma ,США) и культивировались при температуре 38,5ºС в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O2 и 90% N2 ) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.

Для опыта по определению эффективности оплодотворения ceкcированной cпepмы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%.

Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.

Таким образом, сравнивая вышеперечисленные данные можно сделать вывод, что оплодотворяющая способность ceкcированного и традиционного семени не имеет значительных расхождений.

Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени. Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то, что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием cпepматозоидов флуоресцентной краской из за чего снижается энергетический запас, что и может обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным семенем, как следствие остановку развития некоторых эмбрионов.

Тем не менее, несмотря на чуть менее высокие результаты по выходу ceкcированных эмбрионов, от одной дозы семени в среднем было получено 8 эмбрионов, а частота рождения тёлочек при пересадке эмбриона составила 93%.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладают высоким потенциалом и позволяют получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro, а так же могут использоваться для получения, зигот и предымплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.

Доктор сельскохозяйственных наук Голубец Л.В.;

Кандидат сельскохозяйственных наук Дешко А.С.;

Главный биотехнолог Хромов Н.И.;

Старший эмбриолог Машталер Д.В.

Длительное культивирование эмбрионов in vitro

Длительное культивирование эмбрионов in vitro